Этикетка

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 3625 (2023) Цитировать эту статью

580 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Исследования на основе биочипов в настоящее время приобретают трехмерную и крупномасштабную основу, аналогичную микросреде in vivo. Для долгосрочного живого изображения этих образцов с высоким разрешением нелинейная микроскопия, позволяющая получать многомасштабные изображения без меток, становится все более важной. Сочетание неразрушающей контрастной визуализации будет полезно для эффективного определения областей интереса (ROI) в крупных образцах и, следовательно, минимизации фотоповреждений. В этом исследовании фототермическая оптическая когерентная микроскопия (ОКМ) без меток служит новым подходом к обнаружению желаемой рентабельности инвестиций в биологических образцах, которые исследуются с помощью многофотонной микроскопии (МПМ). Слабое фототермическое возмущение в образце с помощью лазера MPM пониженной мощности было обнаружено на эндогенных фототермических частицах внутри ROI с использованием высокочувствительного фазово-дифференцированного фототермического (PD-PT) OCM. Путем мониторинга временного изменения сигнала фототермического отклика PD-PT OCM горячая точка, генерируемая внутри образца, сфокусированного лазером MPM, была расположена в зоне интереса. В сочетании с автоматическим перемещением образца по оси x-y фокальная плоскость MPM может эффективно перемещаться к желаемой части объемного образца для целенаправленной визуализации MPM с высоким разрешением. Мы продемонстрировали возможности предложенного метода в микроскопии генерации второй гармоники с использованием двух фантомных образцов и биологического образца - фиксированного насекомого на предметном стекле микроскопа размерами 4 мм в ширину, 4 мм в длину и 1 мм в толщину.

Многофотонная микроскопия (МПМ) позволяет проводить анализ с высоким разрешением в различных областях биологических исследований. В последние годы использование MPM продолжает набирать популярность в биомедицинской визуализации, особенно в областях визуализации глубоких нейронов in vivo и живых клеток мелких животных1,2,3,4,5, раннего обнаружения опухолей и их характеристики6,7, 8,9, визуализация сосудистой сети и органоидов в их микроокружении в биочипах10,11,12. Было много подходов к увеличению глубины изображения, увеличению поля зрения (FOV) и сокращению времени объемного сканирования за счет применения соответствующих флуорофоров13, адаптивной оптики14, многолучевых и многофокальных механизмов15,16, а также других подобных модификаций. в оптической установке, которая предоставила варианты систем визуализации MPM, которые можно адаптировать в соответствии с потребностями визуализации и сценариями применения 5,16,17,18,19,20,21.

Фотоповреждение и фотообесцвечивание являются критическими факторами, которые следует учитывать при многофотонной визуализации. При длительном освещении, сопровождаемом высокой мощностью лазера, необходимой для многофотонной визуализации без меток, существует фотомеханизм повреждения тканей, который приводит к усилению флуоресценции, вызывающей гибель клеток, что широко называют фотоповреждением 22,23,24. Чтобы избежать возникновения фотоповреждения в живых клетках, необходимо позаботиться о том, чтобы параметры изображения были значительно ниже порога фотоповреждения, такого как пиковая интенсивность, частота повторения и время длительного воздействия (выдержки)24. Большинством этих параметров можно управлять с помощью систем источника и обнаружения. Несколько исследовательских групп изучали и предлагали различные подходы к подавлению эффектов фотообесцвечивания и фотоповреждений. Самый простой и наиболее распространенный метод – уменьшить общую мощность освещения источника света4,25,26. Однако это, в свою очередь, снижает общую чувствительность системы из-за снижения отношения сигнал/шум. Сообщается, что альтернативные подходы к смягчению этого эффекта включают метод контролируемого светового воздействия, который пространственно контролирует свет, попадающий на образец, использование пассивного разделителя импульсов, который перераспределяет осветительный лазерный импульс на субимпульсы с равными энергиями, и быстрое оптическое сканирование. механизм, который уменьшает фотоповреждение путем контроля освещения и сбора излучения от образцов27,28,29,30. Кроме того, при использовании метода освещения световым полотном эффективно освещается только фокальная плоскость объекта обнаружения31. Хотя эти методы полезны для уменьшения эффектов фотоповреждения и фотообесцвечивания, при поиске области интереса (ROI) в больших образцах с небольшим полем зрения и длительным временем объемного сканирования требуется длительное мощное освещение, что приводит к фотоповреждениям и фотообесцвечиванию.